根據(jù)藥品注冊的國際技術(shù)要求(ICH)中雜質(zhì)的含義, 雜質(zhì)分為有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)和殘留溶劑。有關(guān)物質(zhì)是雜質(zhì)的一種, 主要是指有機雜質(zhì)。它的檢查方法很多, 而其中的HPLC法具有專屬性強、分離效果好、靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好、操作簡便等諸多優(yōu)點, 且能與多種類型檢測器聯(lián)合應(yīng)用, 能滿足大多數(shù)化合物種類的檢測需要, 比較符合有關(guān)物質(zhì)檢查時雜質(zhì)含量低、種類多的特點 。

HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)的測定方法很多, 計算方法也相應(yīng)很多,每種計算方法都有不同的意義及其優(yōu)缺點, 下面參考國內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)期刊文獻, 結(jié)合在藥品檢驗中的實際工作, 對這些計算方法作一簡單探討, 以期為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立或進行相關(guān)研究時對有關(guān)物質(zhì)檢查中已知雜質(zhì)的計算方法的選擇提供借鑒和參考。

表1是各種計算方法的計算公式及其主要優(yōu)缺點。

1　面積歸一化法

優(yōu)缺點：

具有與稱樣量及進樣量基本不相關(guān)的特點, 因此重復(fù)性和重現(xiàn)性均良好, 不需要折算, 降低了實驗中對稱樣量精密度的要求, 降低了檢驗成本, 操作更加簡便、快捷, 省去了計算過程。但當(dāng)雜質(zhì)是微量的時候需增加方法的靈敏度, 就要增加進樣量, 此時主成分可能超出儀器檢測范圍, 或雖然在儀器檢測范圍內(nèi), 理論上講此時可能與主成分不在同一線性范圍內(nèi)。正是由于各雜質(zhì)的響應(yīng)因子不同、含量較低和需要較寬的線性范圍等因素的影響,《中國藥典》2005年版二部附錄中特別強調(diào)“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外, 一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查” 這也在一定程度上限制了本法的使用。
 

2.1　不加校正因子的主成分自身對照法

此方法是現(xiàn)行版《中國藥典》和其他國家藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥品研發(fā)時制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用最多、最廣泛的有關(guān)物質(zhì)的測定方法和計算方法。

方法介紹：

本法是配制一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤鹤鳛閷φ杖芤? 一般是由供試品溶液直接稀釋得到。本法不需要雜質(zhì)對照品, 當(dāng)無法獲得雜質(zhì)對照品時, 可采用不加校正因子的主成分自身對照法來計算雜質(zhì)的含量。同面積歸一化一樣, 本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、所有雜質(zhì)均與主成分分離且各雜質(zhì)和主成分的響應(yīng)因子均相同的前提下進行的。

優(yōu)缺點：

同面積歸一化一樣, 本法的優(yōu)點是操作簡單、運算方便, 無需雜質(zhì)對照品;缺點是忽略了各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同的事實, 導(dǎo)致了實驗測得的雜質(zhì)含量可能與真正的雜質(zhì)含量不一致。

此外, 不加校正因子的主成分自身對照法會存在稀釋步驟、進樣針和進樣閥殘留、進樣誤差等影響因素, 往往也會導(dǎo)致計算出的雜質(zhì)與真實含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主成分自身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現(xiàn)的儀器檢測范圍和線性范圍問題。

2.2　加校正因子的主成分自身對照法

目前在國內(nèi)應(yīng)用較少, 但在國外藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用比較廣泛。

方法介紹：

該方法的操作步驟基本與2.1 相同, 唯一不同的是在計算時把雜質(zhì)相當(dāng)于主成分的響應(yīng)因子考慮進去。本法相當(dāng)于一個簡化的內(nèi)標(biāo)法, 同時也是對雜質(zhì)對照品外標(biāo)法的簡化, 即在研究方法學(xué)時, 利用雜質(zhì)對照品和主成分對照品, 分別測定雜質(zhì)和主成分的線性方程, 以斜率之比計算雜質(zhì)相對于主成分的校正因子, 此校正因子可直接載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中, 在常規(guī)檢驗時用以校正該雜質(zhì)的實測峰面積。在實際測定時, 可采用相對保留時間進行雜質(zhì)定位。

優(yōu)缺點：

此法的優(yōu)點是在日常檢驗中省去了雜質(zhì)對照品(特別是在雜質(zhì)不夠穩(wěn)定或?qū)砉?yīng)有困難時顯得尤其重要), 同時又考慮到了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測定誤差;缺點是相對保留時間在不同實驗室間可能有所波動, 特別是當(dāng)供試品中存在多個雜質(zhì)而又分離不好時可能造成雜質(zhì)定位困難。需要指出的是，如果已知雜質(zhì)對主成分的相對響應(yīng)因子超出0.9 ～ 1.1范圍時, 宜用加校正因子的主成分自身對照法或雜質(zhì)對照品外標(biāo)法法進行計算。

3　主成分對照品外標(biāo)法

《美國藥典》多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法來對已知雜質(zhì)進行計算。

方法介紹：

主成分對照品外標(biāo)法包括加不校正因子的主成分對照品外標(biāo)法和加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法。操作、計算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分自身對照法基本一樣，唯一不同的是前者要用主成分對照品制備一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ掌啡芤? 后者是由供試品溶液直接稀釋得到一個濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤骸?/p>

優(yōu)缺點：

由于主成分對照品是經(jīng)過標(biāo)定的, 其純度或量值會比較準(zhǔn)確, 而制劑中主成分的實際含量與標(biāo)示量有時會不完全一致, 因此采用對照品外標(biāo)法計算出的雜質(zhì)的實際絕對含量要比自身對照法準(zhǔn)確一些。當(dāng)然, 由于本法要使用主成分對照品，從而導(dǎo)致操作成本會提高一些, 操作過程會繁瑣一些。

4　雜質(zhì)對照品外標(biāo)法

方法介紹：

雜質(zhì)對照品外標(biāo)法要求提供一定純度的雜質(zhì)對照品, 分析時需制備一個濃度應(yīng)與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛殡s質(zhì)對照品溶液。由于雜質(zhì)對照品外標(biāo)法可以解決上述幾種測定方法和計算方法存在的種種問題, 特別是雜質(zhì)與主成分響應(yīng)不一致的問題, 因此, 本法能反映藥品中該雜質(zhì)的真實含量。
優(yōu)缺點：

如果雜質(zhì)對照品容易獲得并能持續(xù)供應(yīng), 建議在有關(guān)物質(zhì)檢查中已知雜質(zhì)的測定和計算時首選該法, 特別是當(dāng)該雜質(zhì)與主成分的相對響應(yīng)因子相差較大(超出0.9 ～ 1.1范圍)或該雜質(zhì)有毒副作用時, 歐美藥典中采用此法進行有關(guān)物質(zhì)計算的品種也不在少數(shù)。

雖然雜質(zhì)對照品的獲得和供應(yīng)比較困難, 在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中是否引入雜質(zhì)對照品應(yīng)權(quán)衡并慎重, 但由于該法能真實反映藥品中某一雜質(zhì)的含量, 因此采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法應(yīng)該是今后有關(guān)物質(zhì)檢查時努力的方向。
 

5　加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法

方法介紹：

加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法其實也是雜質(zhì)對照品外標(biāo)法的一種。本法的操作方法與測定方法同雜質(zhì)對照品外標(biāo)法一樣, 不同的是在計算公式中多乘以一個轉(zhuǎn)換因子, 其意義就是把樣品中某一雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的重量百分比水平。

假設(shè)某一制劑的標(biāo)示量為100 mg, 采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計算出某一雜質(zhì)的含量為主成分的1.0%, 若該雜質(zhì)與主成分的分子量之比為1∶2, 則按加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計算出的該雜質(zhì)的含量為2.0%, 即該雜質(zhì)的真實含量為1.0mg, 但通過分子量之比換算成相當(dāng)于主成分的含量為2.0mg。
 

優(yōu)缺點：

結(jié)果較準(zhǔn)確。但由于雜質(zhì)的分子量可能大于或小于主成分的分子量(即主成分的分子量/雜質(zhì)的分子量可能小于1或大于1), 因此采用本法計算出的某一雜質(zhì)的含量結(jié)果也可能比面積歸一化法、主成分自身對照法、主成分對照品外標(biāo)法和雜質(zhì)對照品外標(biāo)法計算出的結(jié)果偏低或偏高。
 

6　加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法

方法介紹：

加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法其實也是主成分對照品外標(biāo)法的一種, 就是在加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法的基礎(chǔ)上乘以轉(zhuǎn)換因子。
 

優(yōu)缺點：

其操作和優(yōu)缺點與加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法一樣, 其意義與加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法一樣, 也是通過雜質(zhì)和主成分分子量之比的換算把該雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的百分比水平。
 

7　內(nèi)標(biāo)法

方法介紹：

按各品種項下的規(guī)定, 分別精密量取含有一定濃度內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對照品溶液和供試品溶液, 注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 測定對照品溶液中對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積及供試品溶液中待測成分(這里指待測雜質(zhì))和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積, 根據(jù)表1 中的公式計算雜質(zhì)的含量。
 

優(yōu)缺點：

內(nèi)標(biāo)法主要是為了解決儀器進樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問題, 這種方法可以抵消儀器和過程帶來的誤差。但在以常壓六通閥定量環(huán)進樣和回收率已經(jīng)驗證的情況下, 意義已不大, 加之內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇比較困難, 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的添加會導(dǎo)致分離難度的增大, 操作過程更加煩瑣等問題, 本法已經(jīng)使用很少。

現(xiàn)舉例說明不同計算方法對HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)測定結(jié)果的影響?？垢哐獕核庱R來酸依那普利片中有關(guān)物質(zhì)的計算方法。

《中國藥典》2005年版二部中所有雜質(zhì)(包括已知雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮)采用的均是不加校正因子的主成分自身對照法 ;

《英國藥典》2008年版中已知雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮采用的是雜質(zhì)對照品外標(biāo)法, 其他雜質(zhì)采用的是不加校正因子的主成分自身對照法;

《英國藥典》31 版中已知雜質(zhì)依那普利拉采用的是加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對照品外標(biāo)法, 依那普利雙酮采用的是加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對照品外標(biāo)法, 其他雜質(zhì)采用的是不加校正因子的主成分對照品外標(biāo)法。

由于不同計算方法所表示的意義不同, 所以得出的結(jié)果也不相同。表2 就是某企業(yè)生產(chǎn)的馬來酸依那普利片, 按上述不同計算方法得出的雜質(zhì)的含量結(jié)果。

由表2可知, 不同的計算方法得出有關(guān)物質(zhì)中已知雜質(zhì)和總雜質(zhì)的含量不盡相同, 如果采用統(tǒng)一的限度, 就會出現(xiàn)同一雜質(zhì)采用不同的計算方法, 結(jié)果在有些情況下符合規(guī)定, 而有些情況下不符合規(guī)定的現(xiàn)象, 這種情況下只能根據(jù)不同的計算方法和有關(guān)要求制訂合理的限度。

隨著液相色譜技術(shù)的進一步完善, 新型檢測器的不斷開發(fā), 以及各種類型檢測器的聯(lián)合應(yīng)用, HPLC將在有關(guān)物質(zhì)檢查中發(fā)揮更大的作用。

文章來源：《中國藥品標(biāo)準(zhǔn)》

作者：余振喜, 庾莉菊, 黃海偉, 張啟明